Нет.
Как правило, все, что делает медиаплеер, это просто воспроизводит файл, то есть получает дескриптор файла из системы и читает данные файла. В большинстве случаев данные даже предварительно кэшируются с диска в основную память, поэтому на воспроизведение не влияет доступ к диску из других программ, и ваш жесткий диск не всегда будет считываться.
В любом случае, медиаплеер, как правило, не записывает в файл, что означает, что ваш файл не будет затронут. Даже если процесс неожиданно завершает работу (например, принудительно завершает его), операционная система просто освобождает дескриптор файла.
Вы даже можете проверить это. Посмотрите, изменится ли какая-либо информация файла (например, отметки времени, "измененное" время) при воспроизведении. Ни один порядочный игрок не должен делать это без активного изменения информации и нажатия кнопки "Сохранить". Есть некоторые игроки, которые ведут себя по-другому, хотя.*
* Например, iTunes автоматически обновит информацию ID3 в файлах MP3, как только вы что-то измените в диалоговом окне "Информация". По моему мнению, это не то, как это должно работать, но сохранение файлов происходит только один раз, а это означает, что вы, скорее всего, не просто "потеряете" файл, если что-то пойдет не так.